β-Laktamáz, HLE és koleszterin ACAT enzim inhibitorok

A β-Laktamáz enzim

A penicillin gyógyászatba történő bevezetése után nem sokkal már észlelték, hogy a patogén mikroorganizmusok közül egyesek ellenállóvá váltak az antibiotikummal szemben. Abraham és Chain már 1940-ben talált egy enzimet, amely elbontotta a penicillint. Az enzimet penicillináznak nevezték el (ekkor még nem tudták, hogy a penicillin β-laktám gyűrűt tartalmaz). 1949-ben egy angliai kórházban már a Staphylococcus pyogenes törzsek több mint fele rezisztenssé volt. Ez a szám azóta csak növekszik. Természetesen vannak eleve ellenálló törzsek is. A mikrovilág szereplői és ember közötti folyamatos rabló-pandúr játék miatt a kemoterápia fegyvereit folytonosan meg kell újítani. Ahogy a legfertőzőbb középkori járványnak is mindig voltak túlélői, ugyanígy a legerősebb antibiotikumok, kemoterapeutikumok esetén is van egy kis minor része a baktérium populációnak, amely valamilyen ok miatt ellenállóbb, túléli a támadást, és elszaporodva már mint rezisztens többség jelenik meg.

A rezisztenssé válásnak több oka is lehet. A bakteriális sejtburok külső membránja megváltozhat úgy, hogy az antibiotikum nem jut át a porinokon, a lipopoliszaccharid réteg pedig kedvezőtlen az ionos antibiotikum spontán diffúziója számára. A Gram-negatív baktériumok jelentős részénél ez az eredeti rezisztencia oka. Másrészt, a hatás szempontjából fontos PBP vagy target enzim megváltozhat úgy, hogy a molekula nem tud jól kötődni vagy hatni. Harmadrészt, a periplazmikus térben megjelenő β-laktamáz tönkreteszi, elhidrolizálja az antibiotikumot, mielőtt még az a hatás helyére érkezhetne.

A β-laktamáz enzimek, amelyek a β-laktám gyűrű hidrolízisét katalizálják, a Gram-pozitív baktériumoknál többnyire az extracelluláris, míg a Gram-negatívoknál többé-kevésbé a membránhoz kötötten, a periplazmikus térben találhatók. Az enzimnek sok fajtáját kimutatták és izolálták. Többféleképpen osztályozhatók: szubsztrát specifitás szerint (penicillinázok, kefalosporinázok, karbapenemázok), genetikai kódolásuk szerint (kromoszómában vagy azon kívűl, R-plazmidban kódoltak), molekulatömeg, stb. szerint. A következő táblázat öszefoglalja a klinikai törzsekből izolált fontosabb β-laktamáz enzimeket. Mint látható, szerkezetileg két fő és négy altípusuk van:

Az A, C és D típusúakban az aktív centrumban egy szerin molekula létesít kötést a szubsztráttal (nukleofil támadás a β-laktám gyűrű karbonil csoportja ellen). A β-laktamázok szerkezete nagy hasonlóságot mutat a DD-karboxi peptidázokkal, így valószínű a közös evolúciós eredet. A legjobban az A típusúakat tanulmányozták. A B típusú β-laktamázok aktivitásához cink szükséges, amelyet egy tiol csoport segítségével köt meg, ezek konkrét hatásmódja még kevéssé ismert.

Ma már sok A típusú β-laktamáz háromdimenziós szerkezete is ismert, sőt ezeknek pontmutációs variánsaival sikerült elég pontosan felderíteni az aktív centrumban történteket. A következő ábrán végigkövethető a penicillénsav kialakulása a jelenlegi elképzelés szerint. A nukleofil támadás szempontjából a szerin-70 és a szerkezeti víz-712 a legfontosabb. A lizin-234 szintén majdnem minden penicillint felismerő proteinben előfordul s a karboxi csoportnál fixálja a molekulát. A glutamin-166 nem szükséges az acilezéshez, de esszenciális a penicilloesav leválásához. A két lépés sebességében igen nagy a különbség, az acilezés k állandója átlagosan 10³ körüli, a deacilezésé sokkal lassabb, 10^-4 körüli.

β-Laktamáz gátló antibiotikumok és analógok származékok

A β-laktamáz enzim elleni harc kétfrontos lehet: vagy magát az antibiotikum molekulát tesszük ellenállóvá az enzimmel szemben, vagy külön enzimgátló szerrel (amelynek nem feltétlenül jó az antibakteriális hatása) kell megvédeni az érzékeny antiotikum molekulát.

A passzív ellenállóképesség egyik legrégebbi példája a penicillineknél a meticillin, valamint újabban a 6α-metoxi- és 6α-formamido-penicillinek és kefalosporinok. A harmadik-negyedik generációs amino-tiazol oldalláncú kefalosporinok is már eléggé ellenállnak az enzimnek. Mindezeket a félszintetikus penicillineknél és kefalosporinoknál említettük. Az ismert struktúrájú TEM-1 β-laktamáz és a cefepim kölcsönhatását MM módszerrel modellezve azt találták, hogy az amino-tiazol oldallánc és néhány, az aktív centrum közelében lévő aminosav kölcsönhatása következtében kedvezőtlen helyzetbe kerül a hidrolízisben résztvevő víz-712 molekula. Léteznek egyébként meticillin rezisztens baktériumok, például az ún. MRSA (meticillin rezisztens St. aureus) törzsek, amelyek komoly klinikai problémát jelentenek, mivel egyúttal sok egyéb antibiotikumra is rezisztensek. A β-laktám antibiotikumok közül főleg a legújabb karbapenemek azok, amelyek jól hatnak rájuk.

A jó antibiotikus hatás és a β-laktamáz enzimgátlás elvileg egy molekulában is ötvözhető. Ez az eset ritkább, de éppen egy régebbi penicillin család ilyen, nevezetesen az izoxazolil penicillinek (oxacillin, cloxacillin, stb.), ezeket kombinációkban is fel lehet használni, amint ezt már a félszintetikus penicillineknél említettük.

Jelentős β-laktamáz gátló hatással rendelkezik a természetes karbapenem antibiotikumok egy része, főleg azok, amelyek a C-2 oldalláncban a kénatomot oxidált formában tartalmazzák, mint a pluracidomicinek, egyes olivánsavak, karpetimicinek, valamint a telítetlen C-6 etilidén szubsztituenst hordozó asparenomicinek. Sok β-laktamáz típusnál azonban a karbapenemek gátlása nem bizonyult irreverzibilisnek, hosszabb inkubáció után az enzim visszanyeri az aktivitását. Több kísérlet is történt megfelelő analógok kifejlesztésére, például asparenomicin származékoké.

Gyakorlati szempontból eddigelé a legjelentősebb természetes gátlószer a klavulánsav, erről részletesen s hatásmechanizmusáról a klavulánsavval foglalkozó fejezetben számoltunk be. Loosemore és Pratt még 1978-ban írta le a 6β-bróm-penicillánsav β-laktamáz gátló hatását. A vegyület három úton állítható elő: egyrészt a 6-APA-ból közvetlen diazotálással kapható és oldatban epimerizálódó 6α-bróm származéktól való elválasztással, másrészt a dibróm származék szelektiv redukciójával, előnyösen tributil-ónhidriddel. A 6β-vegyületet magát először Daehne izolálta tisztán. A sztereospecifikus szintézist a 6α-trifluor-metánszulfonil- (vagy -fluorszulfonil-) penicillánsav nukleofil cserereakciójával végezték. A továbbiakban mindenfelé óriási kutatómunka indult ezeknek az eleddig elhanyagolt származékoknak vizsgálatára. A penicillineknélmár bemutattunk sok diazotáláson alapuló reakciót, itt csak 6β-bróm-penicillánsav előállítását foglaljuk össze:

Kiderült, hogy a brómhoz hasonlóan a többi halogén származék, a dihalogének és a vegyes halogén származékok egy része is rendelkezik β-laktamáz gátló hatással, ugyanígy az oxidált származékok is: például a 6β-klór-penicillánsav jó gátlószer, az α-izomer viszont nem. Viszont a 6α-klór-penicillánsav szulfon megint jó hatású.

A 6β-bróm-penicillánsav irreverzibilisen gátol sok különböző mikroorganizmusból származó szerin-típusú β-laktamázt. Hatásmechanizmusa alapján ún. öngyilkos (suicid vagy mechanism-based) típusú gátlószernek nevezik, vagyis a molekulát az enzim szubsztrátjának ismeri fel, azonban a target molekula hidrolízise után az nem tud leválni az enzimről, hanem újabb kémiai átalakulások után irreverzibilisen kötve marad:

A B fázisban a 6α-hidrogén sztereospecifikus eltávolítását valószínűleg az enzim egy bázikus csoportja végzi. A D dihidrotiazin vázas vegyület egyébként halopenicillinánsavkból in vitro is képződik bázisok hatására.

A 6β-bróm-penicillánsav és a többi hasonló halogénszármazék kutatásába nagy energiát fektettek be, azonban gyakorlati felhasználásukat végül megakadályozta, hogy kémiailag nem eléggé stabilak. Megjegyzendő még, hogy nemcsak a halogén származékok, hanem egyéb soft nukleofil analógok (tiocianát, cianid, stb.) is mutatnak több-kevesebb enzimgátló hatást, valamint a megfelelő kefalosporin származékok is.

A különböző penicillin-szulfoxidok és -szulfonok is elég kifejezett β-laktamáz gátló hatással rendelkeznek. A cloxacillin-szulfon is hatásos inhibitora a TEM-típusú penicillinázoknak; érdekes módon a molekula eközben epimerizálódik. Az oxidált származékok szisztematikus vizsgálatával kiderült, hogy a legjobb hatású a szubsztituálatlan alapvegyület, a penicillánsav-szulfon, amely a sulbactam nevet kapta. Előállításának legelőnyösebb módja a 6-APS diazotálásával kapott 6,6-dibróm-penicillánsav oxidációja és reduktív dehalogénezése. A szulbaktám szintén öngyilkos típusú gátlószer. A következő ábrán látható vázlatosan az E. coli RTEM laktamázzal való reakciója: az acilezés után kialakult B enzim-szubsztrát komplex kétféle képpen alakulhat tovább: vagy az enzimnek egy újabb csoportjával reagálva a szulbaktám kétszeresen, és így irreverzibilisen kötődik az enzimhez (C) azt működésképtelenné téve, vagy leválik az enzimről és elhidrolizál különböző töredékekké (E). A gátlószer reakcióképességét itt a szulfon csoport biztosítja, amely mint jó elhagyó csoport szerepel (-SO₂^–), amit bizonyít az is, hogy a szulfon csoportot a gyűrűben eggyel arrébb, a kettes helyzetben tartalmazó analóg teljesen inaktív:

A szulbaktam önmagában nem túl jól felszívódó anyag, ezért gyógyszerként aktív észtere, vagy ampicillinnel képzett észtere formájában alkalmazzák (szultamicillin, Unasyn), amint azt már a félszintetikus penicillineknél is említettük.

Valamivel több figyelmet érdemelnek viszont a 2-szubsztituált penicillinek. Mint ezt már a penicillinekről szóló fejezetben is elmondtuk, ezeket sokáig csak a gyűrűbővítési reakció nemkívánt melléktermékeiként tartották számon, azonban a laktamázgátló hatásuk felfedezésével az érdeklődés középpontjába kerültek. Az alábbi ábrán láthatunk néhány jóhatású származékot. Ezek közül egyedül a tazobaktám került gyakorlati felhasználásra, a piperacillinnel való kombinációja Zosyn™ néven van forgalomban. Előállítások általában a könnyen előállítható 2-halogeno-metil-penicillinből indul ki, a tazobaktám előállítását a penicillineknél láthattuk.

A klavulánsav, szulbaktám és tazobaktám hármas több, mint egy évtizeden keresztül az egyedüli laktamázgátlók voltak a piacon. Csak 2012-ben csatlakozott hozzájuk az AstraZeneca és a Forrest Pharmaceuticals közös fejlesztése, az avibaktám nevű újszerű származék. Ez egy diaza-biciklooktán származék, bár felfogható egy γ-laktámnak is. Az A,B és D osztályú β-laktamáz enzimekre hat, azonban laktamáz ellenálló széles sávú kefalosporinokkal is érdemes kombinálni, mert azok hatását is megnöveli. Jelenleg (2014) a ceftazidimmel, ceftarolinnal és aztreonammal való kombinációja van phase II-III stádiumban.

Az eddig megismert β-laktamáz gátlók sok különböző kromoszomális vagy R-plazmid kódolta penicillinázra, kefalosporinázra, stb. hatnak, természetesen az egyikre jobban, a másikra kevésbé. Közös azonban bennük, hogy csak az A, C és D osztályúakra, vagyis a szerin proteáz típusúakra. A cink-proteázokhoz tartozó, B-osztályú β-laktamázok inkább csak a legutóbbi időben, a penem-rezisztens törzsek megjelenésével okoznak gondot. Ezekre az eddigi, a szerin típusú β-laktamázok ellen hatásos gátlószerek nem hatnak. Bár találtak néhány alkalmas vegyületjelöltet, ezek szelektivitáa kicsi, így a metallo-laktamázok gátlása mindezideig megoldatlan probléma.

Humán leukocita elasztáz (HLE) inhibitorok

Bár összefoglalásunk célja a β-laktám vázas antibiotikumok áttekintése, meg kell említenünk, hogy e vegyületek egy teljesen más alkalmazási területére bukkantak rá bő tíz évvel ezelőtt, nevezetesen a rutin tesztelés során több vegyületről kiderült, hogy humán leukocita (vagy neutrofil) elasztáz (HLE) enzimgátló hatással rendelkezik. Ez a szerin proteázokhoz tartozó enzim főleg a neutrofil fehérvérsejtekben található, és szerepe a testidegen anyagok, sérült szövetek eltávolításának, lebontásának elősegítése. Szerepéből következőleg az enzim szubsztrátspecifitása nem túl nagy és a fehérjék széles körét képes lebontani, azonban ezeken belül is az elasztint igen könnyen hidrolizálja. Az elasztin a bőrben, véredényekben, tüdőben előforduló oldhatatlan szerkezeti protein. Normális körülmények között, amikor nincs rá szükség, az enzim hatását belső, endogén gátlószerek tartják kordában (α1-proteináz inhibítor). Krónikus gyulladásos folyamatokban, immunreakciókban, vagy külső toxikus befolyáskor (pl. dohányfüst) a proteináz/antiproteináz egyensúly felborul, s a HLE a saját szöveteket támadja meg. Szerepét kimutatták olyan betegségekben, mint a reumatoid artritisz, ateroszklerózis, tüdőtágulás, krónikus bronchitisz stb. A témáról jó összefoglalásként ld. a $44 irodalmat. Az enzim működését nagyon vázlatosan a következő ábra tünteti fel, s a katalitikus hatás lényege dióhéjban az, hogy a ser-195 OH protonja a his-57 közvetítésével a bontandó amid kötés nitrogénre kerül; a B állapot tetraéderes átmeneti állapotát röntgendiffrakciós vizsgálatok is megerősítik. A keletkezett C acil-enzim komplex azután víz felvételével hidrolizál:

A fenti betegségek kezelésére sok különböző szerkezetű HLE gátlószert leírtak, ezek közül egy csoportot alkotnak a β-laktám vázas vegyületek. Ezek kutatásában a Merck jutott legmesszebbre, legjobb vegyületeik humán fázisban vannak, de a Pharmacia Farmitalia kutatói is jó hatású vegyületeket tettek le az asztalra. Gyakorlatilag két típus vált be. A Merck készítette monociklikus β-laktám származékokra a 3-as helyzetben a dietil csoport, az 1-es és 4-es helyzetben az aránylag lipofil aromás szubsztituensek a jellemzők:

Mind a Merck, mind a Farmitalia kefem származékai kivétel nélkül szulfonok, a 7α helyzetben metoxi (esetleg klór) csoporttal. Figyelemre méltó, hogy eltérően az antibakteriális hatású vagy a β-laktamáz gátló kefalosporinoktól, a 4-es helyzetben nem szükséges a szabad karboxil csoport, sőt a kifejezetten a lipofil, nagy alkil csoportot tartalmazó észterek, amidok vagy ketonok a legjobbak. Ezt azzal magyarázzák, hogy a hatás során a molekulának ez a része az enzim egy lipofil kötőzsebébe kerül. Jó hatásúak a különböző C-2 szubsztituált származékok is.
A kefalosporin származékok előállításánál kulcslépés a 7α-metoxi szulfon vegyület sztereospecifikus kialakítása az aminból diazotáláson keresztül. A diazovegyületet alkoholban Rh-só jelenlétében bontják meg, amikoris az in situ keletkezett karbén azonnal reagál az alkohollal; az oxidálás a diazocsere előtt vagy után is végrehajtható. Az általában egy edényben végrehajtott több lépéses reakció gondos optimalizációt igényel:

Koleszterin abszorpció inhibítorok

Néhány szóban meg kell még említeni a monociklikus β-laktám származékok egy egészen új, a Schering-Plough kutatói által 1994-ben leírt hatásterületét, a koleszterin abszorpciójának a gátlását. Ennek az érrendszeri betegségek kialakulásának a megelőzésében igen nagy a potenciális lehetősége. A hatás a koleszterin aciltranszferáz (ACAT) enzim gátlásán alapszik, s ez megakadályozza a koleszterin-észterek lerakódását az érfalba. Az egyik legigéretesebb ilyen vegyület a Sch 58235 volt. Mint kiderítették, a vegyület a szervezetben a metabolizmus első lépéseként glukuroniddá alakul. Érdekes módon ennek metilészterre mintegy ötször hatásosabb, mind az eredeti molekula:

Az Sch-58235 az ezetimib INN nevet kapta és Zetia™ vagy Ezetrol™ néven került forgalomba.